Экзема, псориаз

Вестник дерматологии и венерологии, N 5-1998, стр. 37–40.

Содержание биотина в сыворотке крови у больных экземой и псориазом

А. Л. Тищенко
Кафедра кожных и венерических болезней, курс заболеваний, передаваемых половым путем, Российского Университета дружбы народов, Москва

Разработана оригинальная методика микробиологического определения биотина (витамин B8, или витамин H) в сыворотке крови (2 мл), которая с помощью фермента щелочной фосфатазы позволяет исследовать свободную, связанную с белками и общую форму этого витамина. Значительный дефицит биотина выявлен у больных экземой и псориазом. Более выраженное снижение содержания витамина B8, особенно его связанной с белками формы, наблюдается также у больных экземой и псориазом, злоупотребляющих алкоголем, что указывает на целесообразность использования биотина в комплексном лечении этих дерматозов.

Биотин (витамин B8, H, или антисеборейный фактор) – органическое соединение, необходимое для тканевого роста, имеющее в своем составе серу.

Биотин содержится в продуктах, в которых находятся витамины группы В. Больше всего его в печени, почках, соевой муке, яичном желтке, дрожжах и горохе. В организме человека биотин синтезируется бактериями кишечника. Биотин необходим для осуществления нормальных энергетических процессов, для роста, для синтеза жирных кислот, антител, пищеварительных ферментов и метаболизма никотиновой кислоты. Этот витамин обладает инсулиноподобной активностью и понижает содержание сахара в крови [2, 4]. Известно около десяти ферментативных систем, для работы которых необходим биотин. При недостатке биотина у человека наблюдаются общая слабость, потеря аппетита, тошнота, депрессия, сонливость, повышенная утомляемость, раздражительность, болезненность и слабость мышц, а также сухая или жирная себорея кожи, очаговое облысение и перхоть [4, 9]. Язык бледный и гладкий, слизистые оболочки рта и гортани серого (бескровного) цвета. В крови снижается содержание гемоглобина и повышается уровень холестерина и сахара [2, 3]. Один из компонентов яичного белка – авидин – обладает способностью связывать биотин, образуя с ним нерастворимое соединение. В эксперименте при употреблении в пищу большого количества сырого яичного белка развивается себорейный, а в дальнейшем эксфолиативный дерматит с выпадением волос и ногтей. Назначение биотина ликвидирует этот процесс. Отсюда возникло предположение, что себорея и выпадение волос могут быть в какой-то степени связаны с недостатком витамина B8, поэтому его и назвали антисеборейным фактором [11].

Имеются отдельные сообщения об эффективности биотина при назначении его больным нейродермитом, дисгидрозом, экземой, некротическим акне и псориазом. Показана эффективность применения витамина B8 в лечении детей, страдающих болезнью Риттера, себорейной экземой и болезнью Лейнера-Муссу [9, 11].

Материал и методы

Для количественного определения биотина в сыворотке крови нами был использован в качестве базового отечественный микробиологический метод, предложенный Н. А. Помощниковой для определения содержания витаминов B5 и B6 в растительных объектах [6, 7]. Применительно к крови Е. М. Рахмалевич и Л. Д. Тищенко в 1963 г. разработали микробиологические методики определения свободной, связанной с белками и общей формы витаминов B5 и B6 в крови [8]. Позднее, в 1975 г., на основе этих методик теми же авторами были разработаны новые микробиологические методики определения витаминов B1 и PP в крови, включая свободную, связанную с белками и общую форму этих витаминов [10]. Одновременно этими же авторами также была разработана и опробована в клинических условиях микробиологическая методика определения в крови биотина.

Методика определения биотина в сыворотке крови

В качестве индикаторной культуры в этом методе используется весьма чувствительная дрожжевая культура Saccharomycodes ludwigii KМ. Количество биотина определяется по нарастающей массе дрожжей. Применяемая для постановки опыта дрожжевая культура выращивается на сусло-агаре, приготовленном из сусла (7 Bal) с добавлением 2% агара. Для исследования используется свежая культура дрожжей, пересеянная за 1–2 дня до опыта на сусло-агар и сохраняющаяся до этого в термостате при 27 C.

Для своего роста дрожжевая культура нуждается в получении извне витаминов: тиамина, пиридоксина, биотина, никотиновой и пантотеновой кислот. Индикаторная (дрожжевая) культура предназначается для засевания витаминизированной сахароминеральной среды Ридера при проведении исследования. В состав среды Ридера, из расчета на 5 л, входят следующие ингредиенты: сахароза (2%), сульфат аммония (0,3%), сульфат магния (0,07%), поваренная соль (0,05%), нитрат калия (0,04%), дигидрофосфат калия (0,1%) и гидрофосфат калия (0,01%).

Среда Ридера готовится на кипяченой водопроводной воде и стерилизуется в автоклаве при 0,5 атм в течение 30 мин. Целесообразно готовить одномоментно не менее 5 л среды Ридера с последующей расфасовкой в колбы вместимостью 500 мл. При подготовке среды Ридера каждый составляющий ее ингредиент растворяется отдельно в 50–100 мл кипяченой воды и фильтруется через смоченный водой бумажный фильтр. Сахароза в количестве 100 г растворяется в 500 мл кипяченой воды, куда затем для просветления раствора добавляется 25 г активированного угля. Этот раствор встряхивается в течение 45 мин на Шидль-аппарате, после чего раствор фильтруется, а ретентат (остаток) промывается 4–5 раз кипяченой водой. Автоклавированная среда хранится в прохладном месте. Накануне опыта производится повторное автоклавирование. Если при автоклавировании среды Ридера образовался осадок, его необходимо растворить добавлением 20–30% серной кислоты. Среду нейтрализуют 10–15% раствором едкого натрия и при помощи индикатора бромтимолблау доводят pH до 5,6–6,2.

Рабочие растворы для тиамина, никотиновой и пантотеновой кислот готовятся в концентрации по 1000 мкг в 1 мл и для пиридоксина – по 100 мкг в 1 мл. Растворы тиамина, пиридоксина и никотиновой кислоты готовят из кристаллических витаминов (B1, B6 и PP), раствор пантотеновой кислоты – из кальция пантотената фирмы «Gedeon Richter» или «Walsh Pharma». Для приготовления рабочего (а для пиридоксина – основного) раствора этих витаминов каждый из них точно отвешивают в небольшом количестве на специальных электронных или электрических весах и растворяют в равном взятой массе количестве миллилитров дистиллированной воды (например, 10,2 мг – в 10,2 мл воды). 1 мл такого раствора будет содержать 1000 мкг витамина. Рабочий раствор пиридоксина готовится путем разведения дистиллированной водой основного раствора витамина B6 в 10 раз. Приготовленные растворы витаминов стерилизуют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Хранить основные и рабочие растворы витаминов необходимо в холоде. Срок годности рабочих растворов – 1 мес.

Построение стандартной калибровочной кривой по биотину для вычисления результатов исследования производится следующим образом: за 1–2 сут. до опыта индикаторную дрожжевую культуру пересевают на сусло-агар и выдерживают в термостате при 27 C. Перед опытом из выросшей культуры готовят разведенную суспензию на стерильной водопроводной воде (концентрация дрожжей около 0,01%). К 500 мл среды Ридера добавляется тиамин, никотиновая и пантотеновая кислоты по 1000 мкг и пиридоксин по 100 мкг, т. е. по 1 мл каждого из рабочих растворов витаминов. Среду стерильно разливают по 10 мл в небольшие эрленмейеровские колбы. В ряд таких колб с витаминизированной сахароминеральной средой Ридера последовательно прибавляют все возрастающие количества (мкг) биотина, раствор которого готовится на бидистиллированной воде из стандартного, кристаллического d-biotine фирмы «Roche». При этом в 1-ю колбу добавляется 1 мл раствора биотина, в котором содержится 1 мкг витамина B8, во 2-ю – 2 мкг, в 3-ю – 4 мкг, в 4-ю – 8 мкг, после чего количество добавляемого в колбы биотина увеличивают не в геометрической, а в арифметической пропорции, т. е. в каждую последующую колбу добавляют раствор биотина, содержащего 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 мкг и т. д. до 160 мкг витамина B8.

Колбы засевают одной каплей свежеприготовленной дрожжевой культуры и помещают в термостат при 27 C на 40–48 ч, после чего содержимое колб фильтруют через предварительно взвешенные мембранные фильтры (N 4), смонтированные на приборе Зейца. Фильтры с осадком высушивают при комнатной температуре до постоянной массы. Вычерчивают стандартную кривую, по оси абсцисс откладывают значения массы высушенной индикаторной, дрожжевой культуры, по оси ординат – соответствующую концентрацию раствора биотина. Стандартная калибровочная кривая строится на основании средних данных трехкратно повторенного опыта.

После построения стандартной кривой переходят к определению содержания свободной формы биотина в крови. По этой методике для определения биотина необходимо 5 мл крови. Методом центрифугирования получают 2,5 мл сыворотки.

Ход исследования: исследуемую сыворотку крови с помощью микропипетки вносят по 1 мл в колбы с витаминизированной средой Ридера (10 мл) и засевают 1 каплей свежеприготовленной дрожжевой культуры. Колбы выдерживают 40–48 ч в термостате при 27C, после чего их содержимое фильтруют с помощью прибора Зейца через предварительно взвешенные мембранные фильтры N 4. Высушенные при комнатной температуре фильтры взвешивают. Прирост массы дрожжей служит для расчета содержания биотина по стандартной кривой. Для вычисления свободной формы биотина в 100 мл сыворотки крови показания стандартной кривой умножают на 100. Ошибка метода при определении свободной формы биотина составляет 2%. При клинических исследованиях такой процент ошибки считается допустимым.

Описанный выше метод был использован при обследовании 34 здоровых человек в возрасте от 19 до 45 лет.

Содержание свободной формы биотина в сыворотке крови здоровых людей колебалось от 18 до 41 нг% и составляло в среднем 28,1 0,2 нг%, что соответствовало показателям содержания биотина в сыворотке крови здоровых людей, полученным Ю. М. Островским [5].

Определение общей формы биотина в сыворотке крови проводилось нами по методу ферментативного расщепления белковых комплексов биотина с помощью щелочной фосфатазы [1, 12]. К сожалению, приготовление органной щелочной фосфатазы доступно не всем лабораториям и ее качество необходимо постоянно контролировать. Преимуществом щелочной фосфатазы является то, что она стабильна в замороженном состоянии в течение 16 мес. Кроме того, гемолитические свойства крови не оказывают существенного влияния на ее активность, которая в норме составляет 3–13 ед.

Исследование общей формы биотина в сыворотке крови проводится точно так же, как и определение свободной формы, с той лишь разницей, что в пробирку с 1 мл исследуемой сыворотки добавляют еще 0,1 мл щелочной фосфатазы, после чего ее содержимое в течение 1 ч выдерживают на водяной бане при 60C. Затем содержимое пробирки переносят в колбы, в которые предварительно помещают по 10 мл витаминизированной сахароминеральной среды Ридера. Результаты исследования определяют по стандартной кривой, построенной аналогичным образом при использовании сыворотки, обработанной щелочной фосфатазой, и отражающей рост дрожжевой культуры в зависимости от присутствующего в сыворотке общего количества биотина. Как оказалось, содержание общей формы биотина у здоровых людей колеблется от 30 до 80 нг% и составляет в среднем 56,3 0,2 нг%.

Исследование общей и свободной форм биотина в сыворотке крови позволяет определить связанную с белками форму витамина B8, уровень которой соответствует разнице между содержанием общей и свободной форм этого витамина. У здоровых людей уровень связанной с белками формы биотина в сыворотке крови составляет 28,2 0,2 нг%.

Результаты и обсуждение

Описанным выше микробиологическим методом определения биотина в крови было обследовано 83 больных экземой и псориазом, включая больных, злоупотребляющих алкоголем. Сводные результаты лабораторных исследований представлены в таблице.

Как видно из таблицы, у больных псориазом и экземой, не отягощенных алкогольным фактором, уровень свободной формы биотина в крови был снижен в 2 раза по сравнению с нормой. Содержание его в крови составляло у больных псориазом – 13,9 2,1 нг%, у больных экземой – 14,4 1,2 нг% (норма 28,1 0,2 нг%). У больных этой группы содержание связанной с белками формы биотина не было снижено и варьировало в пределах нормы. Содержание общей формы витамина B8 у них было снижено незначительно: в 1,4 раза – у больных псориазом (40,2 1,5 нг%) и в 1,3 раза – у больных экземой (41,3 1,8 нг%). У больных, злоупотребляющих алкоголем, содержание свободной формы биотина было также снижено незначительно: у больных псориазом – в 1,5 раза (18,8 1,3 нг%), у больных экземой – в 1,4 раза (20,2 2,7 нг%). В то же время у больных псориазом и экземой влияние алкоголя проявлялось в значительном (в 4,2 и 4,5 раза) уменьшении уровня связанной с белками формы витамина B8 в крови (соответственно 6,7 1,0 и 6,2 1,4 нг%). У этих же больных оказалось сниженным (соответственно в 2,2 и 2,1 раза) содержание общей формы биотина в крови (25,5 1,7 и 26,4 4,5 нг%; норма 56,3 0,2 нг%).

Использованная в нашей работе методика микробиологического определения биотина с помощью ферментативного расщепления белковых компонентов этого витамина позволяет более глубоко оценить нарушения обмена этого витамина у больных экземой и псориазом. Определение одной свободной или общей формы этого витамина не отражает достаточно полно состояние дефицита витамина B8.

По-видимому, наиболее информативным является показатель связанной с белками формы витамина, изменения которого отражают бoльшую степень тяжести патологического процесса в организме больного.

Вероятно, на первом этапе формирования дефицита биотина организм стремится максимально сохранить уровень связанной с белками формы этого витамина, который обеспечивает наиболее важные функции в обмене веществ. С этой целью используются все резервы биотина, которые находятся в организме в виде свободной формы этого витамина. Это происходит до тех пор, пока в организм человека поступает достаточное количество витамина B8 или пока синтез биотина в организме способен обеспечить поддержание концентрации этого витамина в крови на необходимом уровне. По мере нарастания дефицита биотина происходит нарушение процессов биотрансформации в его активное, коферментное состояние, что и выражается в уменьшении содержания связанной с белками формы этого витамина.

Заключение

Таким образом, полученные нами данные указывают на то, что при таких хронически рецидивирующих дерматозах, как экзема и псориаз, имеет место определенная недостаточность биотина. Значительное снижение содержания биотина в сыворотке крови, особенно его связанной с белками формы, наблюдается также у больных экземой и псориазом, злоупотребляющих алкоголем. Все это указывает на целесообразность и патогенетическую обоснованность применения биотина при лечении больных с данными дерматозами. В настоящее время в медицине чаще всего применяется d-biotine фирмы «Roche», который выпускается в ампулах для парентерального введения по 1 мл (5 мг). Постановлением фармакологического комитета Минздрава РФ (протокол № 5, 28.11.96) разрешен выпуск отечественного биотина, который производится как в ампулированной форме в виде 0,05% и 0,1% раствора в 1 мл, так и в таблетированной форме по 0,005 (5 мг).

Литература

1. Асатиани В. С. Ферментные методы анализа. – М.: Наука,1969;740.
2. Идз М. Д. Витамины и минеральные вещества. – Ст-Петербург: КОМПЛЕКТ, 1996;503.
3. Лоу К. Все о витаминах. – М: КРОН-ПРЕСС, 1995; 311.
4. Обербайл К. Витамины-целители. – Минск: Парадокс, 1997;448.
5. Островский Ю. М. Механизмы межвитаминных взаимоотношений. – Минск: Наука и техника, 1973; 263.
6. Помощникова Н.А. Микробиологический метод определения пиридоксина. В кн.: Витаминные ресурсы и их использование. – М.: АН СССР, 1955;3:145 — 151.
7. Помощникова Н. А. Микробиологический метод определения пантотеновой кислоты. – М.: АН СССР, 1955; 3: 152 — 157.
8. Рахмалевич Е.М., Тищенко Л. Д. Микробиологический метод определения свободной и общей пантотеновой кислоты в крови: Сб. науч. трудов ЦКВИ МЗ СССР. – М.,1963; 132 — 137. 9. Студницин А. А., Тищенко Л. Д. Витамины в дерматологии. – М.: Медицина, 1969;167.
9. Тищенко Л.Д., Рахмалевич Е.М. Микрометод определения витаминов B1 и PP в крови. В кн.: Методы исследования функций организма в онтогенезе. – М.: АПН СССР, 1975; 160 — 169.
10. Тищенко Л.Д. Витамины в дерматологии (учебное пособие). – М.: УДН,1987;94. 12. Тищенко Л.Д., Рахмалевич Е.М. Инструкция по постановке метода микробиологического определения биотина в сыворотке крови с помощью ферментативного расщепления белковых компонентов витамина (метод. письмо). – М.: Минзвуз СССР, 1985;1 — 4.